通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
菌落PCR鑒定是T載體克隆連接后鑒定是否有陽(yáng)性克隆（含插入片段）zui方便快捷的方法。但是市面上能見到的菌落PCR鑒定試劑盒采用的都是T3,T7或者SP6等特異T載體引物，只能用于某種特定T載體連接陽(yáng)性克隆的鑒定。通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒
通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
目錄號(hào)：42015
試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：
組成 | 80次-100次 (V015-100) | 400次-500次 (V015-500) |
2 × Taq PCR MasterMix | 1ml | 5ml |
Universal primer F | 50ml | 250ml |
Universal primer R | 50ml | 250ml |
ddH2O | 1ml | 5ml |
儲(chǔ)存：-20 ℃ 保存。
產(chǎn)品介紹：
菌落PCR鑒定是T載體克隆連接后鑒定是否有陽(yáng)性克隆（含插入片段）zui方便快捷的方法。但是市面上能見到的菌落PCR鑒定試劑盒采用的都是T3,T7或者SP6等特異T載體引物，只能用于某種特定T載體連接陽(yáng)性克隆的鑒定。如果使用不同T載體，便需同時(shí)購(gòu)買多種鑒定試劑盒，大大增加了使用成本。本公司采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒，只需購(gòu)買一種試劑盒，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 連接陽(yáng)性克隆的鑒定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點(diǎn)的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時(shí)，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽(yáng)性克隆擴(kuò)增條帶大小接近，無(wú)法區(qū)分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，造成假陽(yáng)性。反之，造成假陰性。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時(shí)的距離至少有150bp以上，加上插入片段的長(zhǎng)度，可以清晰的區(qū)分是插入片段擴(kuò)增出的條帶還是引物二聚體擴(kuò)增出的條帶。避免假陽(yáng)性或者假陰性，大大提高了準(zhǔn)確性。本公司研發(fā)的一管便攜式PCR MasterMix預(yù)混系統(tǒng)，無(wú)需您一一加入各種成分，直接加入需篩選單菌落，經(jīng)過1小時(shí)左右的PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)即可得到重組菌落鑒定的結(jié)果。
預(yù)期擴(kuò)增片段：
T載體名稱 | 載體來源 | 未插入片段時(shí) 通用T載體引物間距離 | 預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 （以插入300bp片段舉例） |
pGEM-T Easy | pGEM | 281bp | 581bp |
pGEMX-T Easy | pGEM | 289bp | 589bp |
pMD18-T | pUC18 | 158bp | 458bp |
pMD19-T | pUC19 | 158bp | 458bp |
pSURE-T | pUC19 | 239bp | 539bp |
pUCm-T | pUC19 | 239bp | 539bp |
pBLUE-T | pBluescript | 300bp | 600bp |
注意事項(xiàng)：
1. 重組菌落鑒定時(shí)，挑取單菌落前，應(yīng)先做好標(biāo)記，便于鑒定后使用。
2. 挑取菌落時(shí)，應(yīng)選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結(jié)果。
3. 設(shè)定PCR 程序時(shí)，請(qǐng)根據(jù)插入片段大小決定延伸時(shí)間，如果插入片段大小為1 kb 以下，延伸時(shí)間30-45 秒即可，如果片段更長(zhǎng)，可按此比例增加延伸時(shí)間。
操作步驟（以25ml體系舉例，客戶也可以采用20ml體系）：
1. 按以下體系配好含有引物的1 x Taq MasterMix 反應(yīng)液。
2 × Taq PCR MasterMix | 12.5ml |
UniversalprimerF(10mM) | 0.5ml |
UniversalprimerR(10mM) | 0.5ml |
ddH2O | 11.5ml |
2. 將過夜培養(yǎng)的平板上的菌落編號(hào)后，使用滅菌的槍頭挑取一部分單菌落加入上述反應(yīng)液，吹打混勻使菌落充分分散到反應(yīng)液中。
可多設(shè)置一管不加菌落的陰性對(duì)照，以便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3. 將PCR管置于熱循環(huán)儀上按以下條件開始反應(yīng)，建議條件如下：
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30-33 cycles
72℃ 0.5-1 min
72℃ 5 min
注意：延伸時(shí)間請(qǐng)根據(jù)插入片段大小調(diào)整。預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)到10分鐘，主要是為了裂解菌落，釋放DNA模板。
反應(yīng)結(jié)束后，取5-10ml直接上樣電泳檢測(cè)。
注：如果細(xì)菌難裂解或者雜質(zhì)多假陰性，嘗試下面的方法，裂解釋放DNA后進(jìn)行。
1. 挑取菌落加入 50ml dd水 （或者10ml dd水中），振搖。
2. 99度，10分鐘滅活菌液中的酶，并釋放DNA。
3. 12000rpm離心1分鐘去除細(xì)胞碎片。
4. 取上清PCR，25ml PCR體系取5ml上清（起始50ml dd水），或者1ml上清（起始10ml dd水）做模板。
通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
