III All-in-one RT Mix with dsDNase反轉(zhuǎn)錄
Script III All-in-one RT Mix With dsDNase是Script III RT Kit WithgDNA Eraser的升級(jí)版，只需一步操作， 僅需15分鐘就可以同時(shí)完成基因組清除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作方便快捷，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兼容染料法和探針?lè)╭PCR，用于檢測(cè)高拷貝或低拷貝基因。III All-in-one RT Mix with dsDNase反轉(zhuǎn)錄
Script III All-in-one RT Mix With dsDNase
（Perfect for qPCR） 打印
III All-in-one RT Mix with dsDNase反轉(zhuǎn)錄
目錄號(hào):71710
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71710-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71710-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x All-in-one RT Mix | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Script III All-in-one RT Mix With dsDNase是Script III RT Kit WithgDNA Eraser的升級(jí)版，只需一步操作， 僅需15分鐘就可以同時(shí)完成基因組清除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作方便快捷，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兼容染料法和探針?lè)╭PCR，用于檢測(cè)高拷貝或低拷貝基因。
本品采用第三代高效逆轉(zhuǎn)錄酶和熱敏型dsDNase，針對(duì)qPCR進(jìn)行特別優(yōu)化oligo dT和N6隨機(jī)引物配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，zui大程度保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。
其中5 x All-in-one RT Mix為一管式逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，含有逆轉(zhuǎn)錄所需的所有試劑（Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer）。
注意事項(xiàng)
1． 避免 RNase 污染。
2． 為保證逆轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的 RNA 樣品。
3． 20μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系建議加入不超過(guò) 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表達(dá)量非常低，最多加入 5μg Total RNA，否則，RNA 量過(guò)高，可能會(huì)超出后續(xù) qPCR 的線性范圍
4． 本產(chǎn)品適用于包含 Ploy (A)結(jié)構(gòu)的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)結(jié)構(gòu)的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小 RNA 模板。
5． 5x All-in-one RT Mix 和 dsDNase 含有高濃度甘油，比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后取用。5x All-in-oneRT Mix 和 dsDNase 內(nèi)包含的酶過(guò)量，即使每次分別按照 3.8 μl、0.9 μl使用，也不影響使用效果。
6． 建議使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反應(yīng)液，并用 PCR 擴(kuò)增儀精準(zhǔn)控溫。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
重要提示：操作前，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心后置冰上備用。
1． 反應(yīng)體系的配制
于冰上，在PCR管中，加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA / mRNA | 50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
5x All-in-one RT Mix | 4 μl |
dsDNase | 1 μl |
RNase-free H2O | To 20 μl |
用移液器輕輕吸打，充分混勻，點(diǎn)甩離心收集至管底。
2． 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
① mRNA模板來(lái)源于真核細(xì)胞(植物、動(dòng)物)，含有Poly(A)尾結(jié)構(gòu)：42℃孵育15min；
② mRNA模板來(lái)源于原核細(xì)胞(細(xì)菌)、病毒，不含Poly(A)尾結(jié)構(gòu)：25℃孵育10min；42℃孵育15 min。
注意：如果模板具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，設(shè)置反應(yīng)程序：
42°C孵育2 min（去除gDNA），50°C孵育15 min (逆轉(zhuǎn)錄)，有助于提高產(chǎn)量。
3． 終止反應(yīng)
85°C加熱5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長(zhǎng)期存放，請(qǐng)分裝后存于-70°C。
qPCR
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