1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第四代高達(dá)60℃的全新高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，極大提高了逆轉(zhuǎn)錄效率（CT值一般提早2-3個循環(huán)）和長度（可合成長達(dá)15 kb的cDNA以及高比例的全長cDNA）1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）（for PCR or qPCR）
1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑
目錄號：71414
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71414-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71414-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x Reaction Mix IV | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) | 50 μl | 100 μl |
Random primer (N6) | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個月。
產(chǎn)品簡介
Script IV 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第四代高達(dá)60℃的全新高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，可以通讀GC含量豐富，二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，極大提高了逆轉(zhuǎn)錄效率（CT值一般提早2-3個循環(huán)）和長度（可合成長達(dá)15 kb的cDNA以及高比例的全長cDNA）；可用于PCR、qPCR等下游實(shí)驗(yàn)。
Oligo(dT)18 和Random primer (N6)是獨(dú)立組分，可以自由選用，以獲得最合適的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果！
本產(chǎn)品采用預(yù)混合技術(shù)和熱敏性dsDNase，只需一步操作，15 min 即可同時完成基因組清除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，極大簡化了操作步驟，避免了復(fù)雜加樣過程造成的樣品污染與RNA降解的風(fēng)險。
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物，shou選Oligo (dT)，與真核生物mRNA的 3’PolyA尾配對，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo(dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下，用于PCR反應(yīng)的GSP無法有效引導(dǎo)第一鏈cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
4. Random primer特異性zui低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導(dǎo)cDNA合成時，可使用Random primer為引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應(yīng)體系），可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結(jié)果的真實(shí)性和重復(fù)性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
1．反應(yīng)體系的配制
提示：操作前，請將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心收集至管底，置冰上備用。
于冰上，在 RNase-Free PCR 管中加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x Reaction Mix IV | 4 μl |
dsDNase | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點(diǎn)甩離心，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產(chǎn)物用于PCR：50℃孵育30 min；
產(chǎn)物用于qPCR：50℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產(chǎn)物用于 PCR，50℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，產(chǎn)物用于 qPCR，50℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混勻，65℃變性 5 min，冰上冷卻，點(diǎn)甩離心后加入其它成分，并將 50℃孵育溫度提升至 55-60°C，有助于增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)效率。
3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長期存放建議分裝后在-70°C保存，cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板。
1. 常規(guī)擴(kuò)增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴(kuò)增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板。如果基因表
達(dá)量較高，請根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用。
相關(guān)產(chǎn)品：
71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同TB Green Premix Ex Taq)
71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)
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91451 高效動物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒 (動物組織、細(xì)胞)
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