微量/臨床基因組DNA快速提取試劑he
本試劑盒采用特制的進口DNA吸附柱和du特的緩沖液系統(tǒng)，特別適合于從微量血液、法醫(yī)材料、干血點、藥簽、口香糖、尿液等微量樣品中分離純化基因組DNA。微量/臨床基因組DNA快速提取試劑he
臨床基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）
微量/臨床基因組DNA快速提取試劑he
目錄號：40215
目錄編號 | 包裝單位 |
40215-50 | 50次 |
v 適用范圍：
適合于從微量血液、法醫(yī)材料、干血點、藥簽等微量樣品中分離純化基因組DNA。
v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 |
裂解液ML | 室溫 | 11ml |
結(jié)合液CB | 室溫 | 15ml |
抑制物去除液IR | 室溫 | 25ml |
漂洗液WB | 室溫 | 10ml 第一次使用前按說明加指ding量乙醇 |
Carrier RNA | -20℃ | 310μg |
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 10ml |
蛋白酶K fen（可選） 20mg/ml | -20℃ | 20mg |
吸附柱AC和收集管 | 室溫 | 50套 |
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果
儲存事項：
1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因為反復(fù)凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3. Carrier RNA 收到時為凍干粉狀，使用前按照注意事項4配制和儲存。
4. 避免試劑長時間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。仔細(xì)閱讀注意事項4。
v 產(chǎn)品介紹：
本試劑盒采用特制的進口DNA吸附柱和du特的緩沖液系統(tǒng)，特別適合于從微量血液、法醫(yī)材料、干血點、藥簽、口香糖、尿液等微量樣品中分離純化基因組DNA。各種來源樣品裂解消化處理后DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜（特別配備了Carrier RNA可以從體系中輕松捕獲微量核酸），再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈的基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。純化后的DNA無雜質(zhì)和PCR抑制劑，可直接適用于PCR分析。
v 產(chǎn)品特點：
1. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2. 節(jié)省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在20分鐘內(nèi)完成。
3. 配備了Carrier RNA 用于充分收集特別微量DNA。
4. 多次柱漂洗確保高純度，提取的DNA 純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可適用于各種常規(guī)操作，包括PCR、酶切、測序、Southern 雜交等。
v 注意事項：
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到所需溫度備用。部分樣品需要準(zhǔn)備1M DTT。
3. 結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. Carrier RNA ：
1) Carrier RNA收到時為凍干狀，使用時加入310μl RNase free 水充分溶解，配制成1μg/μl 溶液。Carrier RNA溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不能超過3 次。所以建議在第一次使用時按自己每次的用量分裝在RNase-free 的離心管中后置于－20℃儲存。
2) Carrier RNA使用方法：如果起始處理量很少（例如小于10μl全血和法醫(yī)樣品），我們推薦使用Carrier RNA，如果預(yù)期有較大量DNA產(chǎn)量，用戶可以根據(jù)需要選擇是否加入Carrier RNA。使用時在每個樣品提取所需結(jié)合液CB 中加入1μl Carrier RNA儲存溶液， 將結(jié)合液CB 與Carrier RNA溶液充分顛倒混勻即可(結(jié)合液CB容易起泡沫,請勿使用渦旋振蕩混勻)。也可根據(jù)樣品數(shù)量，在總共需要的結(jié)合液CB中加入總共需要的Carrier RNA混勻備用。混合液在室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。
3) Carrier RNA加入過多造成DNA洗脫液中Carrier RNA濃度過高，下游PCR反應(yīng)可能受干擾，加入過少可能并不能幫助提高DNA產(chǎn)量和PCR敏感度，因此加入量應(yīng)該在具體試驗中調(diào)整以得到優(yōu)良效果。
4) 由于Carrier RNA 本身是小核酸，所以得到的基因組測定OD260 值會比真實值偏大，建議將得到的基因組直接用PCR 進行檢測。
v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 血液樣品
a. 取1-100μl血液到1.5ml 的離心管中。
b. 如果不足100μl，加入裂解液ML補足到100μl。
c. 加入10μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入100μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。
如果處理樣品<10μl,建議在100μl結(jié)合液CB 中加入1μl Carrier RNA儲存溶液。
d. 冷卻后加入50μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置3分鐘。
如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。
e. 接操作步驟項下7。
2. 干血點
a. 用打孔機打孔的方法在血卡(上面有干血點) 上沖取3mm(1/8英寸) 直徑血卡小片(上面有干血點),最多將3個直徑3mm血卡小片放入1.5ml 的離心管中。
一般血液應(yīng)該點在特定紙或者血卡上面干燥,如903 paper or IsoCode paper (Schleicher & Schuell), BloodstainCard or FTA Card (Whatman), Guthrie test cards, or comparable blood cards.
b. 加入180μl裂解液ML。
c. 加入20μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。
d. 56℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。
如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者h(yuǎn)eating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。
e. 加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。
如果只處理一個3mm血卡小片，建議在200μl結(jié)合液CB 中加入1μl Carrier RNA儲存溶液。
f. 70℃軌道搖床上面900rpm振搖10分鐘。
如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者h(yuǎn)eating block上面進行，每3分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。
g. 接操作步驟項下7。
3. 組織樣品
a. 新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細(xì)粉后或者用解剖dao切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取<10mg，轉(zhuǎn)入裝有180μl裂解液ML的1.5ml離心管中，用大口徑槍頭吹打混勻。
b. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c. 將裂解物放置在56℃水浴過夜或者直到組織消化wan全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
對于小量的組織，一般4－6小時即可，但是過夜消化可以得到優(yōu)良結(jié)果。
d. 加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。
如果處理樣品量少, 建議在200μl結(jié)合液CB 中加入1μl Carrier RNA儲存溶液。
e. 冷卻后加200μl 無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置5分鐘。
如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。
f. 接操作步驟項下7。
4. 口香糖
a. 將30mg口香糖切成小塊放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
b. 56℃軌道搖床上面900rpm振搖至少3小時。
如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者h(yuǎn)eating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。
c. 加入200μl 結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。
d. 70℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。
如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者h(yuǎn)eating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。
e. 冷卻后加200μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
f. 最高速（約14,000rpm）離心1分鐘，取上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
g. 接操作步驟項下8。
5. 法醫(yī)材料
a1. 剪下1 cm2煙頭或者過濾嘴外層紙，切成6小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。
a2. 剪下0.5-2.5 cm2信封或者郵票，切成小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。
a3. 從毛發(fā)根部毛囊處開始剪下0.5-1 cm長度毛發(fā)放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。
a4. 將指甲剪成小塊放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。
a5. 將約0.5cm2信封沾染了血液、唾液、精液的材料剪成小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) (如果是精液需另加入20μl 1M DTT溶液)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。
b. 56℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。
如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者h(yuǎn)eating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。
一般毛發(fā)1小時裂解可以完成，如果不wan全可以延長時間。指甲等難裂解物建議過夜裂解。最后沒有裂解的不溶物在后續(xù)步驟e中會通過離心去除。
c. 加入200μl結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。
d. 70℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。
e. 最高速（約14,000rpm）離心1分鐘，取上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
f. 接操作步驟項下8。
6. 微切割樣品（包括福爾馬林固定的微切割樣品）
a. 加入15μl裂解液ML 到0.2 ml 離心管中，放入微切割樣品。
b. 加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) ，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c. 56℃水浴3小時（福爾馬林樣品16小時）至裂解wan全，中間不時顛倒渦旋。
d. 加入15μl裂解液ML，再加入50μl結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。
e. 冷卻后加入50μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置5分鐘。
如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。
f. 接操作步驟項下7。
7. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
8. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
9. 加入500μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
10. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
11. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
12. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加20－50μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置2-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于20μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
13. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。
v 問題與解決方法
問題 | 評論與建議 |
DNA產(chǎn)量低或者洗脫液中無DNA | *Carrier RNA沒有加入到結(jié)合液CB-建議：仔細(xì)閱讀注意事項4。 *樣品凍融超過1次-建議：盡量使用新鮮樣品和凍融不超過1次的樣品。 *樣品在室溫放置過久-建議：盡快處理樣品或者低溫適當(dāng)方式保存。 *裂解不wan全，蛋白酶K失效了-建議：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。 *結(jié)合液CB和Carrier RNA沒有充分混勻-建議：充分顛倒混勻。 *試劑和樣品沒有充分混勻-建議：加入每個試劑后都要充分混勻。 *洗脫效率不高-建議：確保做了步驟11，否則殘留乙醇會影響洗脫效率，仔細(xì)閱讀步驟12和只使用洗脫緩沖液EB洗脫。 |
DNA的下游反應(yīng)如PCR效果不佳 | * DNA產(chǎn)量低或者洗脫液中無DNA-建議：在下游反應(yīng)中增加DNA用量。 * 洗脫液中太多或者太少的Carrier RNA-建議：確定在下游應(yīng)用中Carrier RNA的最大允許量，調(diào)整結(jié)合液CB中加入Carrier RNA的用量。仔細(xì)閱讀注意事項4。 * 降低的靈敏度-建議：確定在下游PCR應(yīng)用中DNA洗脫液的最大允許用量，減少或者增加DNA洗脫液在PCR反應(yīng)中的用量，DNA洗脫體積也可以相應(yīng)的調(diào)整。 |
DNA下游酶切 | *離心柱殘留有較多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反應(yīng)-建議：確保做了步驟11，然后空氣中晾幾分鐘，讓殘留乙醇揮發(fā)。 *一些硅基質(zhì)膜成分一起洗脫下來，抑制了酶切反應(yīng)-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 |
A260吸光值 | *一些硅基質(zhì)膜成分一起洗脫下來，干擾了吸光值-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 |
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