NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）
NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）NobleRyder 即用型液體試劑 C0836-1mLNobleRyder 即用型液體試劑 C0836-5×1mL
Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、病毒感染等方法能表達pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。
Puromycin的特點是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達pac基因的細(xì)胞。
在革蘭氏陽性菌、動物或昆蟲細(xì)胞中，嘌呤霉素通過抑制蛋白質(zhì)合成而抑制或殺死細(xì)胞。其作用機制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點結(jié)合后，不會參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
Pac基因表達嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發(fā)現(xiàn)的。如果表達基因，就會對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩(wěn)定細(xì)胞株等。例如，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達細(xì)胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
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使用方法
1.建議使用濃度
哺乳動物細(xì)胞：1-10 μg/mL，優(yōu)良濃度需要殺滅曲線來確定；
大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。
2. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的*低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線（kill curve）。
1） Day 1：24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續(xù)的梯度實驗。37℃細(xì)胞孵育過夜；
2） Day 2：a）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL，至少5個梯度）；b）往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細(xì)胞；
3） Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞存活率。
4） 根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基；
5） 每日監(jiān)測細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物*低濃度。
3. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
注意：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時，抗生素作用*明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%。
2）每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
3）篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。注意：每日進行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4）轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實驗做準(zhǔn)備。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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