RIPA主要是從動(dòng)物組織和動(dòng)物細(xì)胞中抽取的可溶性蛋白。
 

　　RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。
 

　　RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。關(guān)于不同的RIPA裂解液以及我們生產(chǎn)的其它裂解液的主要特點(diǎn)和差異，以及如何選擇裂解液可參考附錄。
 

　　RIPA裂解液(強(qiáng))的主要成分為50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白降解。
 

　　RIPA裂解液(中)的主要成分為50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate。
 

　　下面讓我們一起來(lái)了解一下RIPA裂解液的使用方法吧
 

　　對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品:
 

　　1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM。
 

　　2.對(duì)于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
 

　　對(duì)于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。
 

　　裂解液用量說(shuō)明:通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。
 

　　對(duì)于組織樣品:
 

　　1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。
 

　　2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM。
 

　　3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
 

　　4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
 

　　5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
 

　　6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
 

　　注:RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組